도말법 (Spreading & Streaking)

* 미생물 도말 - plate에 굳힌 배지 위에 균액이 스며들게 접종하여 배양시키는 방법 - plate는 뒤집어 놓는다. • 오염 방지 • 중력과 같은 방향으로 미생물이 배양되게 하여 더 잘 자랄 수 있게 해 준다. - 도말법의 목적 : single colony를 얻기 위함 - Spreading (평판도말) • 배양 후 생성된 콜로니의 수를 정확히 계수할 때 주로 사용한다. • 얇게 펴발라서 접종한다. - Streaking (획선도말) • 배지에 특정 콜로니 하나만 따서 배양시킬 때 주로 사용한다. • 선처럼 그어서 접종한다. * Spreading 실험 방법 - ① 균주 배양액을 준비한다. - ② 멸균된 pipette을 이용해 ①의 배양액 100 𝜇L를 배지에 분주한다. - ③ 도말봉(Scrapper, ..

Derivatization (유도체화)

* 시료 유도체화(Derivatization) - Reference • https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168165621001474#bib0080 • Before GC/MS analysis, we derivatized the extracted metabolites by methoxyamination and trimethylsilylation (Lee and Fiehn, 2008). • The methoxyamination step began as we added 10 μL of 40 mg/mL methoxyamine chloride in pyridine (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, US) to the samples a..

[GC/MS] Components ② Column

Reference #1. SHIMADZU, Introduction to Gas Chromatograph Mass Spectrometry 교육자료 #2. https://www.ssi.shimadzu.com/service-support/faq/gas-chromatography/sample-injection/index.html 3. Column * Column Packed Column • I.D. • Length • Packing Material • Liquid Phase 2-4mm 0.5-5m (most case is 2m length) 0.5-25% of Liquid on support The number of theoretical plates is small but many kinds. Capillary..

[GC/MS] Components ① Carrier gas, Injector

Reference #1. SHIMADZU, Introduction to Gas Chromatograph Mass Spectrometry 교육자료 #2. https://www.ssi.shimadzu.com/service-support/faq/gas-chromatography/sample-injection/index.html 1. Carrier Gas - He, N2 가 주로 이용된다. (Capillary column의 경우 He가 권장된다.) - HETP : Theoretical number of plates 당 Column 길이(값이 작을수록 더 잘 분리) - Linear Velocity : capillary column을 따라 흐르는 carrier gas의 속도 Carrier Gas Pros Cons ..

[GC/MS] Introduction

References #1. SHIMADZU, Introduction to Gas Chromatograph Mass Spectrometry 교육자료 #2. https://www.shimadzu.eu/tech-support/fundamentals-gc/gc #3. https://lab-training.com/how-to-read-a-chromatogram/ * GC/MS = GC(Gas Chromatograph) + MS(Mass Spectrometry) * Chromatography : Method for Separation * Chromatograph : Instrument for Chromatography * Chromatogram : Data of Chromatography * Chromatograp..

[GC/MS] Tuning

* Tuning Result 확인사항 - Overall Check Result - m/z : 69.00 m/z : 219.00 m/z : 502.00 - ###Tuning Result### - Spectrum 확인 - Filament 변경 시 유의사항

Streaking (고체배지에 균주 접종)

* 재료 : 균주, 백금이(inoculation loop, platinum loop), 고체배지, incubator * Process ① 70% EtOH로 손을 소독한다. ② 백금이(inoculation loop, platinum loop)를 알코올 램프를 이용하여 화염 멸균한다. ③ 멸균한 loop를 접종할 고체배지에 찍어 시작점을 정한다. ④ 식힌 loop를 이용해 접종할 균을 살짝 찍어낸다. ⑤ 균을 묻힌 loop로 시작점 부분에 첫 번째 획선 배양한다. ⑥ 평판을 90° 돌린 후 첫 번째 획선 배양한 구획과 약간 중첩이 되도록 두 번째 구획에 획선 배양한다. ⑦ 다시 평판을 90° 돌린 후 두 번째 획선 배양한 구획과 약간 중첩이 되도록 세 번째 구획에 획선 배양한다. ⑧ 평판 cover에 추가로..

Colony counting

* 재료 : Spreading 후 고체배지에 배양된 균주 * Process ① 10-3, 10-4, 10-5로 희석시켜 배양된 균주 중 colony가 100-500개 생긴 배지를 선택한다. ② 생성된 colony의 개수를 counting한다.

Spreading (고체배지에 균주 접종)

* 재료 : 균주, 고체배지, pipette, pipette tip, incubator * Process ① 70% EtOH로 손을 소독한다. ② Clean bench에서 10-3, 10-4, 10-5 으로 희석된 균을 고체배지에 100 𝜇L 분주하고 Spreading해준다. ③ ②를 Incubator에 넣고 15-18h 동안 배양한다.

균주 희석

* 재료 : MRS 액체 배지, main-culture 배양액, micro tube * Process ① 0.5 OD (600 nm) 일 때의 main-culture 배양액을 micro tube에 100 𝜇L 분주한다. ② MRS 액체 배지 900 𝜇L를 분주한다. ③ pipetting을 하여 균이 잘 섞이도록 한다. ④ ①-③을 반복하여 10-3, 10-4, 10-5로 균을 희석시킨다.

미생물 Main-culture

* 재료 : pre-culture한 균, autoclave한 MRS 액체 배지(250-mL 용량의 flask에 MRS 액체배지를 100mL 분주한다. x 3), pipette, incubator, cuvette, spectrophotometer * Process ① 250-mL 용량의 flask에 100mL MRS 액체배지를 autoclave하여 준비한다. (3반복 실험을 위해 flask를 3개 준비한다.) ② Pre-culture를 통해 준비한 균을 microtube에 1.3mL씩 접종한다. (contamination 방지를 위해 clean bench에서 작업한다.) ③ 접종 직후 1mL를 취하여 cuvette에 담아 spectrophotometer를 사용하여 600 nm에서의 흡광도를 측정한다. (측..

미생물 Pre-culture

* 재료 : 균 stock, MRS 액체 배지, pipette, conical tube, incubator * Process ① 균이 보관되어 있는 stock을 준비한다. ② conical tube에 8mL MRS 배지를 넣는다. ③ 해동이 완료된 stock에서 100 𝜇l를 pipette을 이용하여 취한다. ④ ③을 ②에 천천히 분주하고 pipetting을 해준다. (균이 액체 배지에서 골고루 잘 섞이게 하기 위함. 너무 강하게 pipetting을 할 경우 균에 영향을 줄 수 있다.) ⑤ 완료 후 마킹 부위에 날짜, 균 이름, 실험자 정보 등을 기입한다. ⑥ 37℃, 200rpm으로 설정된 incubator에 conical tube를 비스듬히 넣은 후에 16h 동안 incubating을 해준다.

MRS 고체 배지 제조

* 재료 및 도구 : Magnetic bar, Magnetic stirrer, Mass Cylinder, autoclave, autoclave tape, 삼각 flask, pipette, pipette tip, Petri dish MRS broth 25.50g D.W. 500mL 사용 도구 : 1L Graduated Cylinder Tween 80 0.5mL 사용 도구 : 1mL pipette Agar powder 7.50g * Process ① 1,000mL 삼각 flask를 준비한다. ② Magnetic stirrer에 Bottle을 놓고 MRS Broth(25.50g)와 D.W.(500mL)를 번갈아가면서 넣는다. (Hotplate 온도 : 2시 방향) (Magnetic bar를 넣고 stirrer..

MRS Broth | Millipore

Manufacturing Co.: Millipore Product No.: 69966 MRS Broth Composition Ingredients Grams/Litre Peptone 10.0 Meat extract 8.0 Yeast extract 4.0 D(+)-Glucose 20.0 Dipotassium hydrogen phosphate 2.0 Sodium acetate trihydrate 5.0 Triammonium citrate 2.0 Magnesium sulfate heptahydrate 0.2 Manganous sulfate tetrahydrate 0.05 Final pH 6.2 +/- 0.2 at 25℃ Attention - Store prepared media below 8℃, protect..

Autoclave(오토클레이브)

* 살균과 멸균의 차이 - 살균 : 따로 규정이 없는 한 세균, 효모, 곰팡이 등 미생물의 영양세포를 사멸시키는 것 - 멸균 : 따로 규정이 없는 한 미생물의 영양세포 및 포자를 사멸시키는 것 * 열 사멸 곡선(TDT Curve, Thermal Death Time)(Fig. 1) • 미생물의 사멸 속도에 미치는 온도의 영향을 나타내는 곡선으로, 로그 F를 가열 치사에 대하여 그린 곡선 • 미생물의 치사 시간은 식품 속의 미생물 세포 수에 비례하며 가열 온도에 반비례한다. • 즉, 가열 온도가 높을수록 가열 시간을 짧게, 온도가 낮을수록 시간을 길게 하여 살균하여야 한다. * 고압멸균(Fig. 2) • 세포의 내생포자를 파괴하기 위해서는 100℃ 이상에서 높은 증기압으로 멸균해야 한다. a. 내생포자(en..

Cell Stock 보관 용액 제조

* 재료 및 도구 Glycerin 50mL D.W. 50mL 사용 도구 : 100mL Graduated Cylinder * Process ① Glycerin : D.W. = 1 : 1 비율로 총 100mL 만들기

MRS 액체 배지 제조

* 재료 및 도구 MRS broth 25.50g D.W. 500mL 사용 도구 : 1L Graduated Cylinder Tween 80 0.5mL 사용 도구 : 1mL pipette * Process ① 1L 삼각 Flask 준비 ② Hotplate stirrer에 Flask를 놓고 MRS broth와 D.W.를 번갈아가면서 넣는다. (Hotplate 온도 : 2시 방향, Magnetic stirrer도 함께 작동) ③ MRS broth와 D.W.가 잘 섞였을 때 1mL pipette로 Tween 80 0.5mL 넣는다. (Tween 80은 점성이 있어 Autoclave 한 tip을 70% EtOH로 소독한 가위로 잘라 사용한다. ④ 완전히 stirrer 한 후 Autoclave 한다. ⑤ Autocl..

피펫(Pipette) or 스포이트(Spuit)의 사용

* 피펫 - 작은 양의 액체를 옮기는 데 쓰는 실험 도구 - 100mL 이하의 정밀한 양의 용액을 옮기기 위해 고안된 기구로, 100mL 이상의 용액을 옮길 때는 피펫이 아닌 메스 실린더를 이용한다. * 종류 - 스포이트 • 관 위쪽에 달린 주머니를 눌러 용액을 빨아들일 수 있는 피펫 • 주로 파스퇴르 피펫(Pasteur pipette)이라고 부른다. • 파스퇴르 피펫 - 눈금 피펫(Graduated pipette, Mohr pipette, Measuring pipette) • 피펫에 일정한 간격으로 눈금이 새겨져 있다. • 피펫의 범위 내에서 필요한 만큼 일정 부피의 시료를 옮길 수 있다. - 홀 피펫(Hole pipette, volumetric pipette, transfer pipette) • 눈금..